|
|
Vývoj rychlé metody cílené mutageneze bakterie Streptococcus zooepidemicus
Černý, Zbyněk ; Španová, Alena (oponent) ; Pepeliaev,, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce je zaměřena na vyvinutí rychlé metody cílené mutageneze genů Streptococcus zooepidemicus založené na přirozené kompetenci buněk. Na základě experimentálních dat byly vybrány geny pro deleci, které s vysokou pravděpodobností mají vliv na syntézu kyseliny hyaluronové. Byla provedena delece vybraných genů z genomové DNA jako důkaz účinnosti metody, a u rekombinantních kmenů S. zooepidemicus byly sledovány změny koncentrace prekurzorů kyseliny hyaluronové (glukuronová kyselina a N-acetylglukózamin) v čase a výsledná produkce kyseliny hyaluronové.
|
|
|
Geny časné meioticke profáze I spermatogeneze myši domácí
Škaloudová, Eliška ; Trachtulec, Zdeněk (vedoucí práce) ; Forman, Martin (oponent)
Meiotickým dělením vznikají gamety nutné pro reprodukci sexuálně se rozmnožujících organismů. Tato práce je zaměřena na popis genů časné fáze meiotického dělení, a to u samců modelového organismu myši domácí. První část práce souhrnně popisuje meiózu s hlubším zaměřením na profázi I, která trvá déle než profáze II. Profáze I se dělí na pět stádií, jmenovitě leptotenní, zygotenní, pachytenní, diplotenní a diakinetické. Dále je stručně popsána myší spermatogeneze a její rozdíly oproti oogenezi. Druhá část práce podává výčet genů, kódujících proteiny nutné k iniciaci meiotického dělení, k párování a synapsi a k iniciaci katalýzy dvouřetězcových zlomů. Dvouřetězcové zlomy jsou opraveny procesem homologní rekombinace, která může vyústit v tzv. crossing-over, což je hlavní zdroj genetické variability. Práce se zabývá časnou fází homologní rekombinace a složkami pro tento proces nezbytnými. Umístění meiotických dvouřetězcových zlomů v genomu není náhodné a je pod kontrolou genu Prdm9, který patrně zastává více rolí, například při vzniku nových poddruhů myši domácí. Znalost genů, kontrolujících ranou fázi meiotického dělení, je nezbytná k pochopení některých příčin neplodnosti nejen u myši, ale i u jiných obratlovců včetně člověka. Klíčová slova: meióza, myš domácí, sterilita, homologní rekombinace,...
|
|
|
The Role of FBH1 in Maintenance of Genome Stability
Šimandlová, Jitka ; chevelev, Igor (vedoucí práce) ; Kratochvíl, Lukáš (oponent)
Genomová DNA je vystavena neustálému působení škodlivých faktorů, které mohou způsobit různé typy jejího poškození. Odstranění těchto poruch je nezbytné pro udržování celistvosti genomu a tudíž i pro přežití celého organismu. V buňkách se proto vyvinuly určité mechanismy, jak tato poškození opravovat. Homologní rekombinace (HR) je důležitým procesem pro odstraňování nejnebezpečnější poruchy DNA, kterou je dvouvláknový zlom. Naproti tomu, spontánní a nežádoucí HR se může prolínat s jinými opravnými drahami, tvořit toxické meziprodukty či způsobit zablokování replikační vidlice. Proces homologní rekombinace proto musí být regulován. Jedním z možných modulátorů jsou DNA helikázy, které jsou schopné zabraňovat nežádoucí rekombinaci. Nově objevená DNA helikáza hFBH1 patřící do rodiny SF1 helikáz se nejspíše účastní regulace HR. Obdobně jako BLM a RECQL5 DNA helikázy z RecQ rodiny, i FBH1 zabraňuje tvorbě, pro zahájení HR nezbytného, presynaptického filamentu. Na druhou stranu, FBH1 se také účastní iniciace HR. FBH1 má tedy jak prorekombinázovou, tak i antirekombinázovou roli. Ve své primární struktuře obsahuje FBH1 mimo helikázové domény také F-box motiv. Díky němu se jako F-box protein váže v Skp1-Cullin-F-box, SCF, komplexu, který specificky rozeznává proteiny určené pro degradaci v proteasomu.
|
|
|
Posttranslační modifikace proteinů účastnících se odpovědi na poškození DNA
Kroupa, Michal ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
- 4 - Abstrakt V každé buňce vznikají denně tisíce poškození DNA, z nichž nejtoxičtější jsou dvouvláknové zlomy (double-strand breaks, DSBs). Signalizace jejich výskytu a následná oprava takto narušeného chromatinu je zprostředkována mechanismem odpovědi na poškození DNA (DNA damage response, DDR), který zahrnuje akumulaci mnoha efektorových proteinů do oblasti DSBs. Akumulace těchto molekul jsou označovány jako ložiska indukovaná poškozením DNA. DSBs jsou v závislosti na přítomnosti sesterské chromatidy opravovány dvěma hlavními mechanismy: homologní a nehomologní rekombinací. Obě tyto dráhy vedou k aktivaci Checkpoint kináz (Chk1 nebo Chk2), které zahajují přestávky v buněčném cyklu a umožňují tak opravu poškozené DNA. Signalizace poškození DNA a aktivace těchto drah jsou regulovány posttranslačními modifikacemi proteinů, což jsou enzymatické reakce zahrnující především fosforylaci, ubiquitinaci a nově objevenou sumoylaci. Nedávno bylo prokázáno, že ubiquitinace poškozeného chromatinu je nutnou podmínkou pro sumoylaci nádorových supresorů 53BP1 a BRCA1. Poruchy těchto modifikací nebo mutace genů pro 53BP1 a BRCA1 vedou k toleranci poškození DNA a následnému narušení genomové integrity, s čímž souvisí vysoké riziko pro selekci buněčných klonů s nádorovým potenciálem. Současné výzkumy se zaměřují na...
|
|
|
RTEL1 as a novel suppressor of homologous recombination
Žítek, Ondřej ; chevelev, Igor (vedoucí práce) ; Kratochvíl, Lukáš (oponent)
RTEL1 patří do skupiny DNA helikáz a u myší sehrává zásadní roli v regulaci délky telomer. Nepřítomnost RTEL1 je spojen se zkrácenou délkou telomer, tvorbou chromozómových zlomů a translokací. Kromě toho se RTEL1 účastní opravy dvouvláknových zlomů DNA a přímo se podílí na udržování genomové stability pomocí potlačování homologních rekombinací rozrušením D smyčky během opravy DNA. Anti-rekombinázové vlastnosti činí z RTEL1 klíčový protein potřebný vprocesech meiózy a mitózy, aby mohla být uskutečněna oprava dvouvláknových zlomů bez nutnosti crossing-overu. Tato oprava je uskutečněna procesem spojování vláken závislých na syntéze (SDSA). Narušení některé z těchto funkcí RTEL1 může u lidí vést ke zvýšené predispozici vzniku gliomů.
|
|
|
Chromozomální poškození a kapacita opravy DNA v periferních lymfocytech jako ukazatelé karcinogeneze.
Kroupa, Michal ; Vodička, Pavel (vedoucí práce) ; Štětina, Rudolf (oponent)
V současné době je známo, že působení faktorů vnějšího i vnitřního prostředí buňky společně s genovými variantami modulují riziko rozvoje sporadických forem nádorů. Strukturní chromozomální aberace v periferních lymfocytech představují biomarker působení genotoxických karcinogenů a jsou považovány za indikátor zvýšeného rizika rozvoje nádorového bujení. Hlavní příčinou vzniku chromozomálních aberací jsou neopravené či chybně opravené dvouvláknové zlomy v molekule DNA; cytogenetickým měřením těchto alterací lze získat představu o tzv. "interindividuální variabilitě" v odpovědi na mutagen. Předpokládané deficience v kapacitě opravy DNA byly v této práci zkoumány u incidentních onkologických pacientů s nádory prsu, tlustého střeva a konečníku a u pacientů s nádory urogenitálního systému. Stanovení chromozomálního poškození bylo doplněno o analýzu vybraných genových variant genů účastnících se opravy poškozené DNA (XRCC3, rs861539; RAD54L, rs1048771). V této studii byla využita konvenční cytogenetická analýza a cytogenetická analýza založená na indukci chromozomálních aberací bleomycinem (tzv. "Challenge assay"), diskriminační analýza TaqMan pro stanovení alelických variant a statistická analýza. Výše uvedenými metodami nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v průměrné hladině chromatidových zlomů...
|
|
|
Mechanismy reparace DNA v mechu Physcomitrella patens
Holá, Marcela ; Angelis, Karel (vedoucí práce) ; Bříza, Jindřich (oponent) ; Fajkus, Jiří (oponent)
Genomy organismů jsou během životního cyklu vystaveny působení vnějších i vnitřních chemických, fyzikálních i biologických faktorů - genotoxinů. Genotoxiny způsobují změny jak struktury DNA tak jejích základních stavebních komponent - cukerných zbytků, fosfodiesterových vazeb i purinových a pyrimidinových bází. Vzhledem k rozmanitosti a četnosti možných poškození DNA si pro udržení stability genomu organismy v průběhu evoluce vyvinuly řadu reparačních mechanismů, které jsou často propojené s dalšími buněčnými dráhami, např. přestavbou - "remodelací" chromatinu, replikací DNA, transkripcí, kontrolou buněčného cyklu či apoptózou - programovanou buněčnou smrtí (PCD). Mechanismy reparace DNA jsou zatím nejlépe prostudovány u kvasinek a savčích buněk, u rostlin však stále zbývá řadu detailů a vztahů objasnit. I přes to, že základní mechanizmy reparačních drah jsou evolučně konzervovány, jsou mezi drahami živočišných a rostlinných buněk významné rozdíly. Předkládaná disertační práce se zabývá a shrnuje výsledky zavedení rostlinného modelového organismu mechu Physcomitrella patens (Physcomitrella) a využití jeho unikátních vlastností jako je vysoká frekvence homologní rekombinace, haploidní vegetativní stav gametofytu a apikální růst filament protonemy při studiu reparace DNA. Studiem působení...
|
|
|
Role DNA reparačních mechanismů v patogenezi myelodysplastického syndromu.
Válka, Jan ; Čermák, Jaroslav (vedoucí práce) ; Pospíšilová, Dagmar (oponent) ; Penka, Miroslav (oponent)
Souhrn Předpoklady a cíle: Vysoký výskyt mutací a cytogenetických abnormalit u pacientů s myelodysplastickým syndromem (MDS) naznačuje přítomnost defektů v mechanismech DNA reparace. První část práce se zaměřuje na monitoraci genové exprese DNA reparačních genů a její změny v průběhu progrese onemocnění. Ve druhé části studie bylo použito sekvenování nové generace k detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP) a mutací v DNA reparačních genech a byla hodnocena možná asociace těchto genetických abnormalit s rizikem rozvoje MDS. Metody: Expresní profilování 84 DNA reparačních genů bylo provedeno na CD34 pozitivních buňkách kostní dřeně pacientů s MDS. Skríningová kohorta sestávala z 28 pacientů a exprese vybraných genů byla dále hodnocena v rozšířené kohortě 122 pacientů se všemi podtypy MDS. Sériové vzorky byly použity k monitoraci exprese genů RAD51 a XRCC2 v průběhu progrese onemocnění. Imunohistochemický průkaz RAD51 rekombinázy byl proveden u trepanobioptických vzorků. Cílené sekvenování exonových oblastí 84 DNA reparačních genů bylo provedeno ve skríningové kohortě MDS pacientů. Real-Time PCR byla použita ke zhodnocení genotypu vybraných SNP v populační studii. Výsledky: Geny RAD51 a XRCC2 vykazovaly odlišnou expresi mezi MDS nízkého a vysokého rizika (p < 0,0001), zatímco exprese genu RPA3 byla...
|
|
|
CRISPR/Cas9-based genome editing in mice: state of the art and future perspectives
Eliáš, Jan ; Kašpárek, Petr (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Mutantní myši jsou klíčové pro odhalení funkce genů in vivo. V posledních letech prošla jejich příprava revolucí díky rychlému rozvoji programovatelných nukleáz, především systému CRISPR/Cas9. Editace genomu založená na vnesení komponentů systému CRISPR/Cas9 do časných vývojových stádií myších embryí umožnila rychlou a levnou přípravu genově deficientních myších modelů, hlavně ve srovnání s tradičními metodami, založenými na modifikacích embryonálních kmenových buněk (ESCs). Schopnost systému CRISPR/Cas9 indukovat na daném místě v genomické DNA dvojvláknový zlom (DSB) umožňuje efektivní narušení správného fungování daného genu díky náhodným mutacím dané sekvence, nebo kompletním vyštěpením daného genu. Přesné modifikace, jako inkorporace fragmentu DNA do daného lokusu, nicméně pořád zůstávají obtížně proveditelné. V této práci shrnuji systém CRISPR/Cas9, jeho použití v produkci mutantních myší a jeho možné modifikace, které by vedly ke zvýšení účinnosti přesných modifikací. Klíčová slova: CRISPR/Cas9, myš, transgeneze, homologní rekombinace
|
|
|
Role of RAD18 in ubiquitin signaling at DNA double-strand breaks
Palek, Matouš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
RAD18 je E3 ubikvitin ligáza, která se podílí na ochraně replikační vidličky před kolapsem způsobeným poškozenou DNA. Narušená funkce tohoto důležitého faktoru regulujícího replikaci byla popsána v souvislosti s některými lidskými nádory. Klinická relevance těchto zjištění však není známá. Cílem této práce bylo zhodnocení vybraných RAD18 variant nalezených u pacientů s nádory prsu a ovarií. Její výsledku ukazují, že RAD18 varianty vykazují defekty nejen v ochraně replikační vidličky, ale i v opravě dvouřetězcových zlomů. U této nekonvenční role RAD18 se ví, že je závislá na činnosti dalších ubikvitin ligáz, jak ale přispívá k samotné opravě zůstává záhadou. Dalším cílem této práce proto bylo osvětlení funkce RAD18 v opravě dvouřetězcových DNA zlomů homologní rekombinací s důrazem na jeho vztah s 53BP1. Výsledná data ukazují, že RAD18 kompetuje s 53BP1 o stejné vazebné místo a efektivně brání jeho akumulaci na poškozenou DNA, čímž podporuje resekci DNA. Tato antagonistická funkce RAD18 je vymezená jak prostorově (do okolí opravného centra) tak i časově (do S fáze). Navíc se zdá, že je regulovaná existencí dvou RAD18 komplexů. Potenciální modely vysvětlující tuto regulaci jsou diskutovány na konci této práce. Klíčová slova: RAD18, oprava dvouřetězcových zlomů, ubikvitinace, nádorové varianty, resekce...
|
host ::
RSS.